« Analyse microbiologique des aliments » : différence entre les versions

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== Le dénombrement de la Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) ==
La FMAT est un indicateur d'hygiène important. En effet, elle permet d'évaluer le nombre d'UFC(Unité Formant colonie) présente dans un produit ou sur une surface. Ce dénombrement cese fait aà 30°C ce qui permet de dénombrer trois grandgrands typetypes de flore:
* la flore thermophile T° optimale de croissance aà 45°C
* La flore mésophile T° optimale de croissance entre 20°C et 40°C
* La flore psycrophile T° optimale de croissance aà 20°C
Comme il s'agit d'un milieu ordinaire, la plupart des micro-organismeorganismes peuvent cese dévelloperdévelopper, sauf ceux qui sont exigeants et les Micro-organismes anaérobie stricts (contact avec l'air). Il est donc préférable de parler de Flore Mésophile Aérobie à 30°C que de "flore totale".
L'unité est l'UFC (Unité Formant colonie)car une colonie observable sur la gélose peut venir d'un micro-organisme isolé, ou bien d'une spore ou d'une micro-colonie.
==== Dénombrement de la FMAT d'une surface ====
Il existe plusieurs techniques possible,et sont relativement simples. Celon les inconvénients et les avantages de Chacune de ces techniques, le responsable qualité devra faire des choix
===== Dénombrement avec une Boite de contact Rodac =====
Les boites rodac sont des boites de pétris prêteprêtes aà l'emploi, avec un milieu gélosé PCA,légerementlégèrement bombé et à bord suréleversurélevé que l'onton pose directement sur une surface. Du TTC est souvent ajouterajouté à la gélose pour stopper les actionactions des détergent et désinfectant et donc compter les survivants. uneUne Boite rodac couvre la surface de 20cm². Les boites ontsont directement misincubées a étuvé aà 30°C pendant 24 H , puis le nombresnombre de colonies observables est compté.
* Avantages : peu de manipulations,rapide,et simple.
* Inconvénients : ne peut cese faire que sur des surface planes, pleines,et seichesséches pour éviter une culture en nappe.
===== Dénombrement avec les écouvillions =====
Les écouvillions ressembleressemblent aà des cotoncotons tiges. Après avoir été trempé dans un tube d'urée tryptophane additionné de TTC, il suffit de le frotter contre la surface et le remettre dans le tube. Après une agitation vive, 1 mL de solution est étalé sur une gélose PCA puis est mis a incubéestincubé aà 30°C pendant 24 H. Ensuite un dénombrement est effectué.
* Avantages: permet d'aller dans les coins difficiledifficiles d'accès.
* inconvénients : besoinsbesoin d'un étalon de surface métallique qui devra être stériliserstérilisé aà chaque fois , (ce qui n'est pas toujours faisablesfaisable), une partie seulement des micro-organismes sontest dénombrésdénombrée(une partie reste dans les fibres de l'ecouvillionsécouvillion).
 
===== Dénombrement par mesure de L'ATP métrie =====
 
Cette méthode cese base sur le fait que les micro-organismeorganismes produiseproduisent de ATP, molécule qui permet de fournir de l'énergie aux cellules, et qui a la propriété de cecse dégradédégrader rapidement quand la cellule meurt. L'ATP sous l'action d'une luciférase, produit un photon (c'est la même réaction qui permet aux lucioles de briller) en considérant que 1 Photon est émise par un ATP , et que la quantité d'ATP est pareilpareille pour chaque micro-organismes, onton peut mesuremesurer la lumière émise et dénombredénombrer les microbes.
 
Le prélèvement cese fait toujours grâce aà un écouvillion adapté. L'embout est alors plongé dans une cuve de solution enzymatique qui extrait l'ATP et la fait réagir. La Cuve est passépassée dans un spectrophotomètre qui donne directement le résultat.
 
* Avantages : Rapide ; moins de 2 minutes, accès aux zonezones difficiles,
* Inconvénients : Investissement financier important, applicable uniquement aux surfaces.
 
==== Dénombrement de la FMAT d'un produit ====
Dans un produit alimentaire, on ne peut pas utiliser ces techniques: les micro-organismes sont présentprésents dans la totalité du produit et non pas seulement en surface. ilIl faut donc prélever un échantillion du produit qui puisepuisse permettre d'apprécier la qualité microbiologique de l'aliment (ex : dans un plat en sauce, on prendra dans les échantillons à analyser aussi bien des légumes, de la viande et de la sauce.)
 
===== Dénombrement de la FMAT d'un produit alimentaire solide =====
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Prenons l'exemple du yaourt: Cet aliment est riche en bactérie lactique. Si vous étaliez 1 g de yaourt pur sur une gélose, vous obtiendriez une culture bactérienne en nappe (il vous serait impossible de compter les colonies)
pourPour éviter ce problème, il faut effectuer des dilutions successives.On a pour habitude de prélever 25g de produit de façon homogène que l'on dilue dans 225 mL d'urée-tryptophane contenu dans un sac spécial. Comme les micro -organismes peuvent être partout dans l'aliment, l'aliment va être broyé dans une machine, puis il faudra procéder comme ce qui suit
 
'''Attention''' : une dilution au 1/10 est déjà réalisée quand 25 g de produit sont mis dans 225 mL d'urée-tryptophane
====== '''Technique des dilutions successives''' ======
 
Prenez un mL du sac avec a une pipette graduée, et transverser le dans un tube contenant 9 mL d'urée tryptophane. Vous venez de réaliser une dilution au 1/10 . cC'est aà dire que si votre lait pur contenaiscontenait 10 000 bactéries/ mL votre second tube en contient maintenant 1 000 / mL. Renouveler l'opération en changeant de pipette et en versant de nouveau 1 mL dans un nouveau tube d'urée tryptophane et ainsi de suite jusqu'à ce que la concentration en bactérie devienne relativement faible. On considère que les colonies sont dénombrabledénombrables si leur nombre est compris entre 30 et 300. Au dessus 300, elle sont indénombrableindénombrables, en dessous 30 on considère qu'elles sont trop rarerares pour être dénombréedénombrées. Pour savoir quand arreter les dilutions , referezreférez vous aux normes des produits.
 
'''remarquesRemarques : '''Les dilutions doivent être faitefaites en milieu aseptique. Homogénéisez bien vos tubetubes entre chaque dilution.
Une fois que vous avez fait votre dernière dilution, vous devez homogénéisezhomogénéiser votre tube et jeter 1 mL de dilution pour avoir une égalité statistique entre les tubes. AnnoterAnnotez vos tubes : (E , pour echantillion puis 1,2,3,....)
 
====== '''Mise en gélose PCA''' ======
[[Image:Dilutions 2.JPG|thumb|300px|mise en gélose PCA]]]]
comme nous l'avonavons vu precedamentprécédament, la gélose PCa est une gélose stantard pour le dénombrement. Commencez par anoter vos boites de pétri, elles doivent contenir sur la tranche :
* la date
* la dilution qui va être utilisée
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'''Attention:''' il devra y avoir deux boites par dilution.
 
Prenez une nouvelle pipette et à partir de la dernière dilution, prélevez 1 ml de dilution que vous repartirezrépartirez en goutte au fond de la boite correspondante, et renouvellez l'opération pour la seconde boite. sansSans changer de pipette remontez à la dilution supérieure, et recommencez et ce ainsi de suite jusqu'aà la première dilution.
 
recouvrezRecouvrez les gouttes d'une couche de gélose PCA en surfusion, et homogénéisez grace à des mouvementmouvements circulairecirculaires.
 
'''attentionAttention:''' trop chaude, la gélose tue les bactéries.
 
quandQuand la gelosegélose a refroidi, passer une seconde couche de gélose PCA ce qui aurasaura pour effet d'immobiliser les bactéries, et donc de former des colonies bien définies.
 
mettez à incuber à 30°C pendant 24 H
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==== Lecture des resultats ====
 
Nous consideronsconsidérons que vous avez obtenu les résultats suivants pour l'analyse de 25 g de yaourt.
 
 
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Il est impossible de compter une boite contenant plus de 300 colonies. Le risque d'erreur est trop important donc elles sont écartées.
Les boites contenant moins de 30 colonies sont elles aussi ecartéesécartées, les colonies sont trop rares et peuvent induire en erreur.
 
La formule mathématique suivante peut être utilisée: